Cómo realizar una tinción de Gram: 18 Pasos

3 partes:Preparación de la cuchilla Haciendo tinción de Gram El examen de los resultados

La tinción de Gram es un procedimiento rápido para identificar la presencia de bacterias en muestras de tejido para caracterizar bacterias tales como bacterias gram-positivas o Gram-negativa basada en las propiedades físicas de las paredes celulares y químicas. Este color casi siempre se debe hacer como el primer paso en el diagnóstico de una infección bacteriana.

El procedimiento fue nombrado en honor al científico danés Hans Christian Gram (1853-1938), quien desarrolló la técnica en 1882 y publicada en 1884 como un proceso de distinguir entre dos tipos de bacterias con síntomas clínicos similares: Streptococcus pneumoniae (también conocido como neumococo), y Klebsiella pneumoniae.

parte 1

Preparación de la cuchilla

Prepárese para trabajar en el laboratorio. Póngase los guantes y atar el cabello largo hacia atrás para evitar la contaminación de la muestra a analizar. Desinfectar un espacio de trabajo bajo el capó química o en otro lugar bien ventilado y ver si el mechero de Bunsen y el microscopio están trabajando antes de empezar.

Esterilizar un portaobjetos de microscopio de vidrio. Si la hoja está sucio, lavarlo con agua y jabón para eliminar la grasa y la suciedad. Desinfectar el uso de etanol, limpiador de ventanas o el método recomendado por el laboratorio.

Coloque la muestra en el portaobjetos. Se puede utilizar el método de tinción de Gram para ayudar a identificar las bacterias presentes en las muestras médicas o cultivos de bacterias que crecen en una placa de Petri. Para que el método sea útil, poner una capa delgado coloración de la muestra. Se recomienda utilizar una muestra con menos de 24 horas de edad, ya que las bacterias de más edad se pueden dañar las paredes celulares que responden de manera menos predecible al proceso.

Si el cheque utilizando una muestra de tejido, coloque una o dos gotas en la diapositiva y extender uniformemente para formar una fina lugar mediante el uso de una segunda lámina de vidrio estéril. Dejar secar antes de continuar.

Si el uso de bacterias en una placa de Petri, esterilizar asa de siembra en un mechero Bunsen hasta que brilla y luego dejar enfriar. Utilizarlo para poner una gota de agua destilada en la hoja y luego esterilizar y secar el mango de nuevo antes de transferir una pequeña muestra de las bacterias y se mezcla suavemente en el agua.

Las bacterias en el caldo se deben mezclar en un agitador y después se añadió con un asa de inoculación que el anterior sin la adición de más agua.

Si usted tiene un hisopo de muestra, rodar el hisopo suavemente por la cuchilla.

Fijar la mancha usando calor. El calor determinará las bacterias en la diapositiva para que no puedan ser lavados fácilmente durante la tinción. Pasar la hoja dos o tres veces rápidamente por la llama de un mechero Bunsen o calentar en un calentador eléctrico de la tira. No se exceda, o puede distorsionar las muestras. Si se utiliza un mechero Bunsen, la llama debe ser un cono azul pequeña, no una llama alta y naranja.

Alternativamente, se puede fijar la mancha adición de una a dos gotas de metanol en la mancha seca eliminando el exceso de producto y dejar secar al aire. Este método minimiza el daño a las células huésped, dando un fondo más limpio.

Coloque la cuchilla en una bandeja de tinción. Se compone de una placa plana de metal, vidrio o plástico con un pequeño alambre de soporte de pantalla o en la parte superior. Coloque la hoja sobre este soporte de manera que los líquidos que se pueden utilizar para drenar en la bandeja.

Si usted no tiene una bandeja de color, la cuchilla puede ser colocado directamente en una forma de hielo de plástico.

parte 2

Haciendo tinción de Gram

Remoje la mancha con violeta de genciana. Utilizar una pipeta para absorber la muestra de bacterias con varias gotas de violeta de genciana, a veces referido como cristal violeta y violeta de metilo. Espere de 30 a 60 segundos. El violeta de genciana se disocia en soluciones acuosas, formando CV + y cloro (Cl). Estos iones penetran en la pared y la membrana de las células gram-positivas y gram-negativas. Los iones CV + interactúan con los componentes de carga negativa de las células bacterianas a púrpura teñirlos.

Muchos laboratorios utilizan violeta de genciana con oxalato de amonio para evitar la precipitación.

Enjuague suavemente la violeta de genciana. Incline la hoja y el uso de un toque para jugar un poco de agua del grifo o destilada en la hoja. El agua debe pasar a través de la superficie de la mancha, pero no se pueden reproducir directamente en él. Ningún otro aclarado no para eliminar la tinción de las bacterias Gram-positivas.

Remoje la mancha con yodo y enjuague. Utilizar una pipeta para cubrir la mancha con yodo y se deja durante al menos 60 segundos. Luego enjuague con el mismo método con cuidado. El yodo en forma de iones de carga negativa, interactúa con CV + para formar complejo grande de violeta de genciana y yodo (complejo CV-I) dentro de las capas interior y exterior de la célula, que sostiene el color violeta dondequiera que esté.

El yodo es corrosivo. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel de él.

Hacer un blanqueador y enjuagar rápidamente. Una mezcla 1 a 1 de acetona y etanol se utiliza normalmente para este paso crítico que debe ser cuidadosamente programado. Mantenga la hoja doblada y añadir la lejía hasta que el violeta ya no es visible en el líquido que sale. El proceso suele tardar 10 segundos o menos, si el decolorante contiene mayores concentraciones de acetona. Inmediatamente detener o eliminar las células positivas y negativas de la mancha violeta de genciana perder el color, haciendo que la prueba será necesario repetirlas. Enjuagar inmediatamente usando la técnica anterior.

acetona pura (gt; 95%) puede ser utilizado en lugar de la mezcla. El más acetona, más rápida será la lejía actuará, lo que requiere un control más preciso de tiempo.

Si usted está teniendo ajustar el tiempo de esta etapa de problemas, considerar la adición de la gota a gota de lejía.

Empapar la mancha con un tinte de contraste y enjuague. El medio de contraste, por lo general safranina o fucsina, se utiliza para añadir un contraste adicional entre la tinción de Gram-positivas y Gram-negativas decolorado (Gram negativa) de color rosa o rojo. Deja por lo menos durante 45 minutos y enjuague.

La coloración se fucsina muchas bacterias Gram-negativas, tales como Haemophilus spp y Legionella spp, con mayor intensidad, por tanto, una mejor opción para los principiantes.

Se seca la hoja. Puede dejar que se seque en el viento o para golpearlo utilizando papel secante vendido para este fin. La tinción de Gram terminó.

parte 3

El examen de los resultados

Preparar el microscopio óptico. Colocar el portaobjetos en el microscopio. Las bacterias pueden variar ampliamente en tamaño, por lo que la expansión requerida total puede variar de 400x a 1000x. En los valores de ampliación más grandes, se recomienda el uso de una lente de objetivo sumergido en aceite para mayor claridad. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre la hoja, evitando muchos movimientos durante la aplicación para evitar las ampollas. Mover la torreta del microscopio de modo que la lente objetivo para mantener en su lugar, tocando el aceite.

El aceite de inmersión sólo se puede utilizar en lentes especiales, no en "seco".

La identificación de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Examine el portaobjetos en bacterias Gram-positivas microscópio- son de color púrpura debido a la violeta de genciana atrapado en sus gruesas paredes celulares. Las bacterias Gram-negativas son de color rojo o rosa como violeta se lavó por paredes celulares delgadas y luego el contraste de color rosa colorante entró por ellos.

Si la muestra es demasiado espesa, se puede ver los falsos positivos. Si todos los tipos de bacterias son gram-positivas, volver a probar con otra muestra para confirmar el resultado.

Si el blanqueo estar actuando durante demasiado tiempo, se puede ver falsos negativos. Si todos los tipos de bacterias son gram-negativas, vuelva a probar con otra muestra para confirmar el resultado.

Buscar imágenes de referencia. Si no está seguro de la aparición de bacterias, ver una colección de imágenes de referencia organizado por el formato y el resultado de la tinción de Gram. Usted puede encontrar en la base de datos en línea Base de datos de América patógenos microbianos, en Las bacterias en Fotos y muchos otros sitios. Para facilitar la identificación, se indican a continuación ejemplos comunes o importantes para el estado de diagnóstico y formato.

La identificación de Gram-positivo por el formato. Las bacterias se clasifican por su forma bajo el microscopio, más comúnmente como cocos (esférica) o Bacillus (cilíndrica). Estas son algunas de las bacterias Gram-positivas común organizados por formato:

la cocos grampositivos en general Staphylococci (cocos en grupos) o Los estreptococos (cocos cadena).

la bacilos Gram-positivas incluyen bacilo Clostridium, Corynebacterium y Listeria. bacilos Actinomyces spp. a menudo tienen ramificaciones o filamentos.

Identificar las bacterias Gram-negativas. Gram negativo (rosa) a menudo se clasifican en tres grupos: los cocos son esféricas, bacilos son largas y delgadas y bacilos cocoides están en el medio.

la Gram-negativo son más comúnmente Neisseria spp.

la bacilos gramnegativos incluyen E. coli Enterobacter, Klebsiella Citrobacter, Serratia, Proteus, salmonela Shigella, Pseudomonas y muchos otros. La bacteria Vibrio cholerae puede verse como bacilos comunes o curvas.

la cocoides gramnegativos (o "cocobacilos") incluyen Bordetella Brucella Haemophilus y Pasteurella.

Evaluar resultados mixtos. Algunas bacterias son difíciles de colorear precisamente a causa de la fragilidad de la pared celular o cerosa. Ellos pueden tener una mezcla de color rosado o púrpura en la misma célula o entre células diferentes de la misma muestra. Cualquier muestra de bacterias con más de 24 horas puede tener este problema, pero algunas especies son difíciles de colores a cualquier edad y requiere pruebas más especializadas para reducir la identificación, como la tinción de Ziehl-Neelsen, la observación de la cultura de crecimiento, agar TSI o pruebas genéticas.

Actinomyces, arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium y Propionibacterium spp. son todas las bacterias Gram-positivas considerados, pero a menudo no pueden generar resultados concluyentes en esta prueba.

El pequeño y delgado como bacterias Treponema, La clamidia y la Rickettsia spp. Son difíciles de colorear adecuadamente usando esta técnica.

Deshacerse de los materiales. La eliminación de residuos procedimientos varían dependiendo del laboratorio usado y materiales. En general, la bandeja de coloración líquido está dispuesta en botellas selladas como residuos peligrosos. Sumergir los portaobjetos en una solución al 10% de lejía y luego tirar a la basura en contenedores para la eliminación de objetos punzantes.

consejos

Recuerde que los resultados de la tinción de Gram es tan buena como la muestra. Es importante enseñar a los pacientes cómo proporcionar buenas muestras que muestra, por ejemplo, la diferencia entre una lengua y un conocimiento más profundo de moco en las muestras de esputo.
Como decolorante, etanol actúa más lentamente que la acetona.
Siga el laboratorio precauciones estándar.
Use un raspado bucal a la práctica debido a que debe contener bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Si ve sólo un tipo u otro, probablemente se está utilizando blanqueo demasiado o demasiado poco.
Puede usar una ropa de madera de primavera predicador para coger la hoja.

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Acetona y etanol son inflamables y retire primero el aceite de su mano, haciendo que la piel para absorber otros componentes químicos con mayor facilidad. Por lo tanto, usar guantes y cuidar.
No permita que la muestra está seca antes de enjuagar la mancha o contramancha.